微生物发酵生产丁二酸

丁二酸，又称琥珀酸，是工业上一种重要的C4平台化合物，广泛应用于食品、医药、表面活性剂、清洁剂、绿色溶剂、生物可降解塑料等领域。微生物发酵方法将来自可再生生物质（如淀粉、纤维素）的还原糖转化为丁二酸，减少化学品对石化原料的依赖，生产过程环境友好。

1.具有自主知识产权高产菌株

①选育出高产的琥珀酸生产菌株

选育自主知识产权的厌氧发酵丁二酸生产菌株琥珀酸放线杆菌A.succinogenes CCTCCM2012036，该菌在 5-15L发酵罐中， 补料分批厌氧发酵 36-48 h 产琥珀酸 70-95.6g/L，生产强度 1.70-1.99 g/(L·h)，糖酸转化率 0.70-0.84 g/ g。该菌株具有高产、 降低生产成本的优势。

图1  该菌5L 搅拌罐补料分批发酵曲线

②改造出高产、高转化率基因工程菌

改造谷氨酸产生菌生产丁二酸，构建出嗜乙酰乙酸棒杆菌工程菌C.acetoacidophilumΔldh。采用双阶段发酵（先好养培养，然后停止供氧，在缺氧状态下催化葡萄糖和碳酸盐合成琥珀酸），3-L发酵罐中发酵75h，丁二酸浓度达到121g/L，对糖平均转化率约为0.85g/g。

现有微生物微生物发酵产琥珀酸，存在需要在高浓度细胞下进行，工业化的难度和应用成本较高等缺陷。本工程菌，具有产琥珀酸浓度和转化率高，生产成本较低，易操作等特点。

图2  3L 发酵罐中 C.acetoacidophilum △ ldhA/pXMJ19-pyc 两阶段法产琥珀酸曲线

2. 开发出纤维床固定化发酵新工艺，可反复生产，操作简单，生产强度高

将琥珀酸放线杆菌在装有棉纤维载体的发酵罐中培养、吸附固定，通过反复分批发酵、反复补料分批发酵、连续发酵或双罐循环连续发酵工艺，提高了发酵的细胞浓度，同时获得高产酸浓度、高生产强度和高转化率。转化率最高达 90%，生产强度最高为 4.27g/L/h，丁酸产量最高为 98.7g/L。

实例1——反复补料分批发酵

反复补料分批发酵运行了4批次，丁二酸平均浓度为88g/L，平均生产强度2.2g/L/h，平均转化率为87%。

表 1 纤维床反应器固定化反复补料分批发酵

实例2——双罐循环连续发酵

用两个 3L 发酵罐，其中一个为纤维床反应器 ，另一个作为循环反应器，两罐以蠕动泵以及橡胶软管相链接。发酵过程开始时，循环罐中的发酵培养基装液量为1.6L，用蠕动泵以80mL/min 向纤维床反应器循环发酵液，每隔 4-6h 由循环罐取样测定葡萄糖与发酵液中的生物量，在发酵液中葡萄糖降低为 10g/L 时，连续发酵开始，新鲜培养基以 0.05/h 稀释率泵入纤维床反应器，发酵液从循环罐中泵出，连续运行 50h 后，流出的发酵液中丁二酸浓度稳定在 60g/ L，残糖浓度为 8.3g/L，转化率 0.84g/g，生产强度为 3.0g/L/h。

图 3 纤维床反应器双罐循环连续发酵装置图

1，纤维床反应器 ；2，循环罐 ；3，蠕动 泵 ；4，蠕动泵 ；5，蠕动泵 ；6，蠕动泵 ；7， pH 电极 ；8， pH 控制器 ；9，蠕动泵 ；10，0.22μm 气体 滤膜 ；11， pH 调节剂储罐 ；12，产物收集瓶 ；13，培养基补料瓶 ；14， CO2/N2 混合气瓶。

3.可利用廉价农林废弃资源发酵，设备投资低、操作费用低、环境友好

利用琥珀酸放线杆菌糖利用谱广的特点，开发了廉价农林废弃资源发酵生产丁二酸工艺。

①秸秆同步糖化发酵生产丁二酸

采用秸秆同步糖化发酵工艺，将秸秆切割粉碎、稀碱预处理，在纤维素酶和琥珀酸放线杆菌共同作用下生成丁二酸，丁二酸产率达到0.55g/g（处理秸秆）。

②甘蔗渣原料发酵生产丁二酸

以甘蔗渣为原料，经过粉碎，稀碱预处理，以及纤维素酶、木聚糖酶、β- 葡聚糖酶和果胶酶的共同水解，得到水解糖液；利用琥珀酸放线杆菌发酵水解糖液生产丁二酸，同时在发酵液中添加甘蔗渣水解的残渣，使得发酵可以反复运行，节省种子培养，而且可以用有机溶剂萃取稀碱预处理后的残液中的糠醛。

本技术将甘蔗渣水解液作为碳源补料，实现了甘蔗渣水解残渣的合理使用，减少常规发酵的种子培养环节，节约了发酵成本、提高了发酵效率。同时对发酵设备要求低，不需要对已有的发酵罐做出额外改进，适合工业化生产。

图4 甘蔗渣发酵丁二酸工艺路线

采用分步糖化补料分批发酵工艺时，发酵50h，丁二酸的产量达到71g/L，糖酸转化率81%，丁二酸的生产强度为1.426g/L/h。

图5 甘蔗渣水解液作为碳源补料分批发酵丁二酸的过程曲线

采用半连续带渣发酵工艺时，在3L发酵罐中带渣、反复分批发酵，均值丁二酸浓度为35g/L，丁二酸的平均生产强度为1.65g/L/h，平均糖酸转化率为81%，整个发酵系统运行64h，没有下降的趋势。

图6 带渣3L发酵罐反复分批发酵丁二酸的过程曲线